Bioeffectors and bacterial elicitors as biotechnological tools in the agrifood industry: a contribution to plant health and food safety.

Abstract

La presente tesis doctoral se centra en el estudio del microbioma de la rizosfera y en las relaciones planta-microrganismos beneficiosos y su influencia sobre la fisiología de las plantas y sobre el metabolismo secundario defensivo y el sistema inmunitario vegetal en general. Este estudio parte de la consideración de la rizosfera como una fuente especialmente rica en microorganismos beneficiosos, que tienen un papel fundamental en mejorar la capacidad de adaptación de las plantas a ambientes cambiantes y que están adaptados al sistema planta-microorganismo gracias a la presión selectiva que han ejercido las plantas sobre el microbioma durante el largo proceso de coevolución. Además, el trabajo surge ante la actual necesidad de desarrollar nuevas prácticas agrícolas de base biotecnológica, efectivas y a la vez sostenibles que minimicen las pérdidas económicas y materiales debidas a las infecciones patogénicas que atacan a los cultivos y también causadas por condiciones de estrés abiótico. De esta manera se persigue aumentar el rendimiento de los cultivos, tanto en cantidad como en calidad de alimentos, para poder proveer a una población en continuo crecimiento y a la vez cumplir con el concepto de seguridad alimentaria propuesto por la FAO. Por todo lo anterior, el presente trabajo se centra en el uso de rizobacterias beneficiosas (PGPR) y de moléculas derivadas del metabolismo de las mismas (elicitores metabólicos) como inoculantes de plantas capaces de inducir el metabolismo secundario defensivo, dando lugar a plantas con un sistema inmunitario más fuerte y, por tanto, plantas mejor preparadas para combatir el estrés biótico y abiótico. Así, el objetivo último del trabajo es desarrollar inoculantes de plantas de origen biológico, con una capacidad bioestimulante efectiva y por ello, capaces de sustituir a los fitosanitarios químicos. La gran novedad que aporta este trabajo es el uso de moléculas elicitoras derivadas del metabolismo de determinadas rizobacterias. Es por esto, que la especie de rizobacteria beneficiosa seleccionada para estudiar su efecto y el de sus elicitores metabólicos sobre el metabolismo secundario de las plantas fue la cepa Pseudomonas fluorescens N 21.4, una cepa cuya capacidad de elicitación y de inducción de resistencia sistémica en distintas especies vegetales ya ha sido ampliamente demostrada por el grupo de investigación. Se comenzó probando la cepa viva como control positivo y distintas fracciones elicitoras de la misma en plántulas de Arabidopsis thaliana en condiciones controladas de laboratorio, estudiando su capacidad de inducción de resistencia sistémica, el nivel de estrés oxidativo de las plantas tratadas y las rutas de transducción de señal implicadas en la respuesta. Después se probó la cepa viva y sus elicitores metabólicos en condiciones reales de campo en cultivos comerciales de zarzamora (Rubus cv. Loch Ness), estudiándose el fitness general de las plantas a través de marcadores específicos, así como la acumulación de compuestos de interés en las hojas y en los frutos y los genes específicos implicados en la maduración de los frutos. Los resultados mostraron que en las plantas inoculadas con los tratamientos existía una relación causal entre la inducción de resistencia sistémica y una reducción del estrés oxidativo en A. thaliana y un mejor fitness general, menor estrés oxidativo y mayor acumulación de compuestos fenólicos beneficiosos en las hojas y frutos de zarzamora. Al demostrarse la capacidad de los elicitores metabólicos de la cepa P. fluorescens N 21.4 de inducir el metabolismo secundario defensivo, se procedió a la identificación química de las moléculas responsables de dicha capacidad, encontrándose siete compuestos muy prometedores dado su potencial capacidad antibiótica y antifúngica. Este estudio termina con la búsqueda de nuevas cepas PGPR (bioefectores) y de sus elicitores metabólicos y con el estudio de las vías de transducción de señal involucradas en la respuesta de las plantas elicitadas con las mismas. De un grupo inicial de ciento setenta y cinco rizobacterias, se seleccionaron dos por sus prometedoras capacidades para utilizarse como inoculantes de plantas en experimentos futuros.

This doctoral thesis focuses on the study of the rhizosphere microbiome and the plantbeneficial microorganism relationship and their influence on plant physiology, on the defensive secondary metabolism and on the plant immune system in general. This study starts from the consideration of the rhizosphere as an especially rich source of beneficial microorganisms, which have a fundamental role in improving the adaptability of plants to changing environments, and which are adapted to the plant-microorganism system thanks to the selective pressure that plants have exerted on the microbiome during the long process of coevolution. Furthermore, the work arises from the current need to develop new, effective and sustainable biotechnology-based agricultural practices that minimize economic and material losses caused by pathogenic infections and abiotic stress conditions. Hence, the aim is to increase the yield of crops, both in quantity and quality of food, in order to be able to provide to a population in continuous growth and at the same time fulfilling the concept of food security proposed by the FAO. For all the above, this work focuses on the use of beneficial rhizobacteria (PGPR) and molecules derived from their metabolism (metabolic elicitors) as plant inoculants capable of inducing the defensive secondary metabolism, getting plants with a stronger immune system and, therefore, plants better prepared to face to biotic and abiotic stress. Thus, the ultimate objective of the work is to develop biological plant inoculants, with an effective biostimulant capacity and therefore, capable of replacing phytosanitary products of chemical origin. The great novelty brought by this work is the use of elicitor molecules derived from the metabolism of certain rhizobacteria. This is why the species of beneficial rhizobacterium selected to study its effect and that of its metabolic elicitors on the secondary metabolism of plants was the strain Pseudomonas fluorescens N 21.4, a strain whose ability to elicit and to induce systemic resistance in different plant species has already been widely demonstrated by the research group. The study began by testing the live strain as a positive control and different eliciting fractions of it in Arabidopsis thaliana seedlings under controlled laboratory conditions, studying their capacity to induce systemic resistance, the level of oxidative stress of the treated plants and the signal transduction pathways involved in the response. The live strain and its metabolic elicitors were then tested under real field conditions in commercial crops of blackberry (Rubus cv. Loch Ness), studying the general fitness of the plants through specific markers, as well as the accumulation of compounds of interest in the leaves and in the fruits and the specific genes involved in the ripening of the fruit. The results showed that in the plants that had been inoculated with the treatments there was a causal relationship between the induction of systemic resistance and the reduction in oxidative stress in A. thaliana and a better general fitness, less oxidative stress and greater accumulation of beneficial phenolic compounds in the leaves and fruits of blackberry. Since the ability of the metabolic elicitors of the P. fluorescens N 21.4 strain to induce the defensive secondary metabolism was demonstrated, a chemical identification of the molecules responsible for that capacity was performed, identifying seven promising compounds for their potential antibiotic and antifungal capacity. This study ends with the search for new PGPR strains (bioeffectors) and their metabolic elicitors and with the study of the signal transduction pathways involved in the response of plants elicited with them. From an initial group of one hundred and seventyfive rhizobacteria, two were selected for their promising abilities to be used as plant inoculants in future experiments.