1. Investigación

Many physiological events occurring during the estrous cycle, including folliculogenesis, oocyte maturation, ovulation, follicular atresia, corpus luteum development, luteolysis, steroidogenesis, and angiogenesis are associated with an increased expression of the renin–angiotensin–aldosterone system (RAAS) in uterus and ovarian follicles. This enhanced expression leads to a rise in plasma concentrations of these hormones in women and laboratory animals, and the same might happen in the mare. This study aims to assess if an activation of the RAAS occurs in mares around ovulation and if this activation is related to the diameter of the predominant follicle (DPF), packed cell volume (PCV), and electrolyte concentrations. Twenty-five healthy Spanish Purebred mares were sampled during the five days before ovulation, the day of ovulation, and the first five days after ovulation. Renin (REN) concentrations increased progressively during the five days before ovulation, achieving the highest values on the day of ovulation. Angiotensin (ANG) concentrations showed a sharp decrease after ovulation, with the lowest values the fifth day after it. Aldosterone (ALD) concentrations increased progressively, from the fifth day before ovulation until the fifth day after ovulation. The highest PCV values were found on the day of ovulation. There were no relevant correlations between the RAAS components and electrolytes concentrations. Before ovulation, there was a positive relationship between REN and ALD (r = 0.760) and after ovulation, a negative correlation between ANG and ALD (r = –0.660). The DPF was correlated with REN (r = 0.740) and with ALD (r = 0.800) concentrations. Ovulation in the mare is associated with high plasma REN concentrations, and therefore, with an activation of the RAAS. In addition, after ovulation, the sharp decrease in plasma REN and ANG concentrations might be a reflex of the modulation of the previously activated RAAS, although plasma ALD concentrations increased during this period.

Durante la gestación se producen ajustes de tipo metabólico y cardiovascular cuyo objetivo va encaminado a preservar la energía y disponer de la cantidad adecuada de nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo del feto equino. Por tanto, este periodo representa un estrés metabólico en la yegua, que podría manifestarse en las características hematológicas, bioquímicas y hormonales. Por este motivo, los objetivos planteados en la presente investigación fueron los siguientes: 1) Establecer valores hematológicos, bioquímicos y hormonales de referencia para la yegua PRE gestante; 2) Analizar el efecto de la gestación sobre el perfil hemático, bioquímico y hormonal de las yeguas y 3) Valorar las modificaciones hematológicas, bioquímicas y hormonales asociadas al envejecimiento de las madres. Se ha estudiado un total de 31 yeguas reproductoras PRE a lo largo de la gestación, la cual fue dividida en tres periodos (I, II y III) de duración similar. Las yeguas fueron clasificadas en tres grupos de edad: A (entre 4 y 9 años, n=21), B (entre 10 y 14 años, n=7) y C (mayores de 15 años, n=3). Se obtuvieron muestras de sangre venosa a lo largo del periodo gestacional, por las mañanas, con una frecuencia mensual. De la extracción realizada a cada una de las yeguas, se separaron dos fracciones, almacenándose en cantidades similares en tubos con heparina-litio, y tubos de vidrio con activadores de la coagulación, para la extracción de plasma y suero, de forma respectiva. Previamente a la centrifugación de la sangre anticoagulada con heparina-litio, se procedió a la realización del microhematócrito. En plasma se analizaron las concentraciones de proteínas y electrolitos, sodio, potasio y cloro, empleando la espectrofotometría y el analizador con electrodos selectivos, respectivamente. Las concentraciones de renina, angiotensina, aldosterona, cortisol, sulfato de estrona y progesterona se analizaron en suero, empleando técnicas inmunoenzimáticas de competición. A nivel hematológico y bioquímico, la gestación en la yegua PRE se caracterizó por un aumento del valor hematócrito, sin modificaciones de las concentraciones de proteínas plasmáticas y electrolitos, sodio, potasio y cloro. A nivel hormonal, la gestación presentó incremento de las concentraciones de renina y aldosterona, disminución de la concentración de cortisol, y fluctuaciones de dirección variable de las concentraciones de progesterona y sulfato de estrona, sin modificaciones apreciables de los niveles de angiotensina II. El avance de la edad en la yegua reproductora PRE se caracterizó por la reducción de las concentraciones de angiotensina II, sodio y cloro, sin modificaciones del valor hematócrito, de las concentraciones de potasio, renina, aldosterona, progesterona, sulfato de estrona y cortisol. En conclusión, el estado fisiológico de la gestación modifica significativamente los parámetros hematológicos, bioquímicos y hormonales en la yegua PRE. La preñez se caracteriza por una marcada actividad del Sistema Renina Angiotensina Aldosterona. Este hecho posiblemente pueda estar relacionado con la interacción de determinados factores metabólicos y hormonales que acontecen durante la preñez en la yegua. En la yegua PRE, la gestación podría enmascarar los efectos hematológicos, bioquímicos y hormonales promovidos por la edad.

El óptimo crecimiento fetal depende de la eficiente función placentaria. El factor de crecimiento placentario (PlFG) favorece la angiogénesis y vascularización de la placenta, asegurando el efectivo flujo sanguíneo placentario esencial para mantener el transporte activo de moléculas y la síntesis de hormonas esteroideas. Por otro lado, los componentes del eje somatotropo (GH e IGF-1), la ACTH, el CORT y las catecolaminas influyen notablemente sobre el desarrollo placentario y el crecimiento fetal. Sin embargo, hasta la actualidad estos mecanismos permanecen desconocidos en la yegua. Por este motivo, los objetivos planteados en la presente investigación han sido los siguientes: 1) Establecer valores de referencia para las concentraciones de neurotransmisores (ADR, NORADR, 5-HT y DA), hormonas hipofisarias (ACTH y GH), placentarias (A4, DHEA, T, E1S y P4), adrenales (CORT) y PlFG e IGF-1 en yeguas gestantes sanas; 2) Examinar si la gestación en la yegua PRE induce modificaciones laboratoriales en las dinámicas de los componentes anteriormente descritos, y 3) Analizar si los cambios hormonales de GH, ACTH, andrógenos, E1S y P4 están implicados fisiológicamente en las modificaciones analíticas que experimentan los diversos neurotransmisores y ambos factores de crecimiento en la yegua gestante PRE. Se ha estudiado un total de 33 yeguas PRE con edades comprendidas entre 5 y 17 años, durante la gestación. Se obtuvieron muestras de sangre venosa por las mañanas con una frecuencia mensual. Las muestras fueron almacenadas en tubos de vidrio con activadores de la coagulación y gránulos PS para desuerado. Las concentraciones séricas de ADR, NORADR, DA y 5-HT fueron determinadas mediante técnicas inmunoenzimáticas (EIA) de competición validadas específicamente para la especie equina (3-CAt EIA; Demeditec, Diagnostics GmbH, Germany; Serotonin-EIA; Demeditec, Diagnostics GmbH, Germany). La cuantificación de ACTH y GH fue realizada utilizando EIA de competición estreptavidina-biotina (Phoenix peptide ACTH human Fluorescent Immunoassay Kit FEK-001-01). Los niveles de IGF-1 se analizaron mediante ELISA de competición (DRG® InternationalInc, IGF-1 equino, EIA-3982, USA). La detección del PlGF se realizó utilizando EIA de tipo sandwich (Demeditec DEE01). Las concentraciones de A4, T, DHEA, E1S, P4 y CORT fueron determinadas mediante técnicas EIA utilizando anticuerpos policlonales obtenidos y caracterizados en el Departamento de Fisiología Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. El inicio de la gestación representa un incremento fisiológico de las concentraciones de ADR, NORADR, DA, P4 y ACTH. Esta elevación de las catecolaminas ADR y NORADR alcanza un pico de secreción máximo simultáneo al incremento de 5-HT, GH, IGF-1, A4, DHEA, E1S y CORT hacia la mitad de la gestación. La preñez tardía constituye un periodo caracterizado por el descenso de NORAD, DA, 5-HT, ACTH y GH e incremento de T. A diferencia de la mujer y otras especies animales en las que mayoritariamente la P4 y el E1S se consideran los principales reguladores de la secreción hipotalámica de NORADR e hipofisaria de GH, la falta de relación entre dichos parámetros sugiere que la síntesis de NORADR, GH e IGF-1 es independiente de la dinámica esteroidea durante la gestación. Aunque las concentraciones de A4, DHEA, T, E1S y P4 muestran un patrón similar al PlFG, la expresión y la síntesis de este factor parecen no estar sometidas a control hormonal de origen placentario. En conclusión, la gestación representa el incremento fisiológico de la actividad de los ejes simpático-adrenal, hipotalámico-hipofisario y somatotropo en la yegua PRE. Los factores y hormonas integrantes en estos ejes junto a las hormonas placentarias y el PlGF podrían ser considerados como marcadores predictivos de funcionalidad placentaria y del avance correcto de la gestación. / The optimal fetal growth depends on the efficient placental function. Placental growth factor (PlFG) favors angiogenesis and vascularization of the placenta, ensuring effective placental blood flow, essential to maintain active transport of molecules and synthesis of steroid hormones. The components of the somatotrope (GH and IGF-1), ACTH, CORT and catecholamines strongly influence on development of the placenta fetal growth. However, these mechanisms remain unknown in the mare. For this reason, the objectives of the present research were: 1) To establish reference values for neurotransmitter concentrations (ADR, NORADR, 5-HT and DA), pituitary hormones (ACTH and GH), placental (DHEA, T, E1S and P4), adrenals (CORT), PlFG and IGF-1 in healthy pregnant mares; 2) Examine whether gestation in the Spanish Purebred mare induces laboratorial modifications in the dynamics of the previously described components, and 3) Analyze whether the hormonal changes of GH, ACTH, androgens, E1S and P4 are physiologically involved in the analytical modifications experienced by the several neurotransmitters and both growth factors in the Spanish Purebred broodmares. A total of 33 Spanish Purebred broodmares with ages between 5 and 17 years, during gestation have been analyzed. Venous blood samples were collected in the mornings on a monthly frequency. Samples were stored in glass tubes with coagulation activators and PS granules to obtaining serum. Serum concentrations of ADR, NORADR, DA and 5-HT were determined using competition immunoenzymatic techniques (EIA) specifically validated for equine species (3-CAt EIA, Demeditec, Diagnostics GmbH, Germany, Serotonin-EIA, Demeditec, Diagnostics GmbH, Germany). Quantification of ACTH and GH was performed using streptavidin-biotin competition EIA (Phoenix peptide ACTH human Fluorescent Immunoassay Kit FEK-001-01). IGF-1 levels were analyzed by competition ELISA (DRG® InternationalInc, equine IGF-1, EIA-3982, USA). Detection of PlGF was performed using sandwich EIA (Demeditec DEE01). The concentrations of A4, DHEA, T, E1S, P4 and CORT were determined using EIA techniques using polyclonal antibodies obtained and characterized in the Department of Physiology of the Faculty of Veterinary of the Complutense University of Madrid. The onset of gestation represents a physiological increase on ADR, NORADR, DA, P4 and ACTH concentrations. This elevation on catecholamines ADR and NORADR reaches a peak of maximal secretion simultaneously with the increase of 5-HT, GH, IGF-1, A4, DHEA, E1S and CORT towards the middle of gestation. Late pregnancy is a period characterized by the decrease of NORAD, DA, 5-HT, ACTH and GH and increase of T. Unlike women and other animal species in which P4 and E1S are considered the main regulators of NORADR hypothalamic and GH pituitary secretion, the lack of relationship between these parameters suggests that the synthesis of NORADR, GH and IGF-1 is independent of the steroid dynamics during pregnancy. Although the concentrations of A4, DHEA, T, E1S and P4 show a pattern similar to PlFG, the expression and synthesis of this factor appear not to be subject to placental hormonal control. In conclusion, gestation represents the physiological increase of the activity of the sympathetic-adrenal, hypothalamic-pituitary and somatotrope axes in the PRE mare. Factors and hormones in these axes together placental hormones and PlGF could be considered as predictive markers of placental function and correct progression of gestation.