Browsing by Author "Gutiérrez Mañero, Francisco Javier"

La presente tesis doctoral se centra en el estudio del microbioma de la rizosfera y en las relaciones planta-microrganismos beneficiosos y su influencia sobre la fisiología de las plantas y sobre el metabolismo secundario defensivo y el sistema inmunitario vegetal en general. Este estudio parte de la consideración de la rizosfera como una fuente especialmente rica en microorganismos beneficiosos, que tienen un papel fundamental en mejorar la capacidad de adaptación de las plantas a ambientes cambiantes y que están adaptados al sistema planta-microorganismo gracias a la presión selectiva que han ejercido las plantas sobre el microbioma durante el largo proceso de coevolución. Además, el trabajo surge ante la actual necesidad de desarrollar nuevas prácticas agrícolas de base biotecnológica, efectivas y a la vez sostenibles que minimicen las pérdidas económicas y materiales debidas a las infecciones patogénicas que atacan a los cultivos y también causadas por condiciones de estrés abiótico. De esta manera se persigue aumentar el rendimiento de los cultivos, tanto en cantidad como en calidad de alimentos, para poder proveer a una población en continuo crecimiento y a la vez cumplir con el concepto de seguridad alimentaria propuesto por la FAO. Por todo lo anterior, el presente trabajo se centra en el uso de rizobacterias beneficiosas (PGPR) y de moléculas derivadas del metabolismo de las mismas (elicitores metabólicos) como inoculantes de plantas capaces de inducir el metabolismo secundario defensivo, dando lugar a plantas con un sistema inmunitario más fuerte y, por tanto, plantas mejor preparadas para combatir el estrés biótico y abiótico. Así, el objetivo último del trabajo es desarrollar inoculantes de plantas de origen biológico, con una capacidad bioestimulante efectiva y por ello, capaces de sustituir a los fitosanitarios químicos. La gran novedad que aporta este trabajo es el uso de moléculas elicitoras derivadas del metabolismo de determinadas rizobacterias. Es por esto, que la especie de rizobacteria beneficiosa seleccionada para estudiar su efecto y el de sus elicitores metabólicos sobre el metabolismo secundario de las plantas fue la cepa Pseudomonas fluorescens N 21.4, una cepa cuya capacidad de elicitación y de inducción de resistencia sistémica en distintas especies vegetales ya ha sido ampliamente demostrada por el grupo de investigación. Se comenzó probando la cepa viva como control positivo y distintas fracciones elicitoras de la misma en plántulas de Arabidopsis thaliana en condiciones controladas de laboratorio, estudiando su capacidad de inducción de resistencia sistémica, el nivel de estrés oxidativo de las plantas tratadas y las rutas de transducción de señal implicadas en la respuesta. Después se probó la cepa viva y sus elicitores metabólicos en condiciones reales de campo en cultivos comerciales de zarzamora (Rubus cv. Loch Ness), estudiándose el fitness general de las plantas a través de marcadores específicos, así como la acumulación de compuestos de interés en las hojas y en los frutos y los genes específicos implicados en la maduración de los frutos. Los resultados mostraron que en las plantas inoculadas con los tratamientos existía una relación causal entre la inducción de resistencia sistémica y una reducción del estrés oxidativo en A. thaliana y un mejor fitness general, menor estrés oxidativo y mayor acumulación de compuestos fenólicos beneficiosos en las hojas y frutos de zarzamora. Al demostrarse la capacidad de los elicitores metabólicos de la cepa P. fluorescens N 21.4 de inducir el metabolismo secundario defensivo, se procedió a la identificación química de las moléculas responsables de dicha capacidad, encontrándose siete compuestos muy prometedores dado su potencial capacidad antibiótica y antifúngica. Este estudio termina con la búsqueda de nuevas cepas PGPR (bioefectores) y de sus elicitores metabólicos y con el estudio de las vías de transducción de señal involucradas en la respuesta de las plantas elicitadas con las mismas. De un grupo inicial de ciento setenta y cinco rizobacterias, se seleccionaron dos por sus prometedoras capacidades para utilizarse como inoculantes de plantas en experimentos futuros.

For the first time in the literature, a relationship between the root application of melatonin and the greater capacity for resistance against Psedomonas syringae DC3000 in tomato plants has been established. Root delivered melatonin (100 μM), induced systemic resistance against pathogen reducing disease incidence by 51%. Mechanisms of action used by melatonin were assessing through different physiological, metabolic, and genetic markers. As a physiological marker, photosynthetic efficiency was studied, with a TARGAS 1 portable photosynthesis system. Metabolic markers were analysed on leaf powder collected 1 week after the pathogen challenge. These markers analysed were grouped into those related to the scavenging of Reactive Oxygen Species (ROS) and oxidative stress (ascorbate peroxidase (APX) activity, hydrogen peroxide (H2O2) concentration, malondialdehyde (MDA) concentration, and proline concentration) and those related to defence mechanisms (ß-1,3-glucanase and chitinase). Genetic markers were studied on leaf powder collected 6 h and 10 h after pathogen challenge. For this, the differential expression of the genes PR1, PR2 and PR3 was studied. Upon pathogen challenge, melatonin reverted the negative effects of the pathogen in net photosynthesis rate achieving similar values to healthy plants. Melatonin reduced oxidative stress, according to lower MDA (29%) and H2O2 (46%), improving ROS scavenging potential by enhancing APX activity (83%) and proline concentration (44%). Melatonin simultaneously triggered the salicylic acid (SA)-mediated pathway and the jasmonic acid/ethylene (JA/ET)-mediated pathway as the enzymatic activities ß-1,3-glucanase (Pathogenesis-Related protein 2; PR2; 103%) and chitinase activitiy (Pathogenesis-Related protein 3; PR3; 44%), markers of the first and second pathways respectively, were enhanced. This enhanced activity was consistent with enhanced expression of genes encoding PR2 and PR3. Results obtained indicate that melatonin, a natural plant compound, could be used in tomato cultivation as an economical and ecofriendly chemical agent against biotic stress.

El desarrollo industrial supone la emisión de múltiples sustancias contaminantes a nuestro entorno (sólidas, líquidas y gaseosas), con el consiguiente deterioro del mismo. En cuanto a las emisiones líquidas, objeto del presente trabajo, la legislación actual (Ley 10/1993, de la Comunidad de Madrid, sobre vertidos líquidos industriales al sistema integral de saneamiento), es cada vez mas exigente con respecto a parámetros químicos y biológicos (DQO, pH, conductividad, DBO5). En los procesos de descontaminación se utilizan, en muchas ocasiones, métodos físico-químicos pero éstos suelen ser perjudiciales para el medio ambiente. Por eso se han desarrollado métodos biológicos, más respetuosos, que son conocidos como mecanismos de biorremediación (uso de plantas y/o microorganismos para eliminar la contaminación existente en un determinado medio). El medio para biorremediar utilizado en este trabajo se conoce como agua de taladrina. La taladrina es una emulsión de agua y aceite (2%) que se utiliza para lubricar y refrigerar la zona de contacto entre las herramientas de corte y los materiales a mecanizar. Pero con el uso, este líquido pierde sus cualidades y se convierte en un residuo (taladrina agotada). La empresa John Deere Ibérica S. A. (JDISA), que suministró el líquido a fitorremediar, realiza un tratamiento de la taladrina agotada mediante el sistema del vacudest, obteniendo una reducción importante de la DQO, desde más de 25.000 ppm hasta alrededor de 4.000 ppm. Después de este tratamiento se obtiene un residuo conocido como agua de taladrina. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un sistema biológico capaz de reducir la DQO de las muestras de agua de taladrina procedentes de los procesos de producción de JDISA. Las muestras están formadas, principalmente, por hidrocarburos lineales, ramificados, aromáticos y aromáticos policíclicos (fluoreno y pireno), aunque aparecen otros elementos químicos de diferente naturaleza. Presentan unos valores de DQO superiores a 1.750 ppm (límite legal establecido por la Ley 10/1993 de la Comunidad de Madrid). El desarrollo del sistema biorremediador se dividió en dos partes. En primer lugar se determinó la especie vegetal con mayor capacidad para reducir la DQO. Para ello, se utilizaron especies con hábitos acuáticos y terrestres y se realizaron diversos ensayos para determinar su resistencia al medio contaminado. La especie que tuvo una mayor resistencia y que era capaz de reducir la DQO por debajo de los límites establecidos por la ley, fue el maíz (Zea mays), con la que se realizaron los ensayos de biorremediación. Paralelamente se buscó un medio en el que las plantas pudiesen enraizar. Este medio tenía que ser biodegradable y no tóxico. El esparto resultó ser el soporte de crecimiento vegetal que más favoreció el enraizamiento de las plantas. En segundo lugar, se aislaron microorganismos de un medio contaminado con hidrocarburos, de las propias taladrinas, del esparto y de un reactor biológico de membrana (R. B. M.). Con estas cepas se desarrollaron sistemas maíz-esparto-microorganismo. Fruto de este trabajo, se solicitó y fue concedida la patente, titulada ¿Procedimiento para la reducción de la DQO de efluentes líquidos aceitosos mediante fitorremediación con maíz-esparto; su aplicación al tratamiento de taladrinas agotadas¿ (P201000684). El sistema maíz-esparto fue el más eficaz en el proceso de fitorremediación, consiguiendo reducciones del parámetro de la DQO en torno a un 60% partiendo de niveles próximos a los 2.000 ppm. Estas reducciones permiten obtener un residuo con estándares de contaminación por debajo de los límites establecidos por la ley 10/1993 de la Comunidad de Madrid. Sólo el sistema de bioaumento desarrollado con un consorcio bacteriano formado por cepas adaptadas a medios contaminados con taladrinas fue capaz de mejorar la fitorremediación. Paralelamente, se realizaron estudios ultraestructurales, observándose una reducción del número de cloroplastos y una fuerte alteración morfológica de los mismos en las plantas que crecieron en agua de taladrina. En la zona radical no se observó una modificación de los haces vasculares, lo que podría permitir la translocación de productos tóxicos a la zona aérea. El sistema de fitorremediación realizado en fases disminuyó el daño causado por el agua de taladrina en las plantas, lo que permitió realizar una segunda fase de fitorremediación mejorando el rendimiento del proceso. Se observó también que la reducción de la DQO ejercida por este sistema fue mayor que la obtenida por el sistema en continuo. Finalmente, se buscó determinar si el sistema de fitorremediación era capaz de reducir la toxicidad del agua de taladrina. Para ello, se realizó un análisis de perdida de bioluminiscencia con la cianobacteria sensor Anabaena CPB4337, que es muy sensible a la presencia de contaminantes. Se observó que la bioluminiscencia emitida por dicha cianobacteria crecida en las muestras fitorremediadas era 2 veces mayor a la emitida en las muestras iniciales, de manera que el sistema de fitorremediación no sólo es capaz de reducir la DQO sino que a su vez es capaz de disminuir la toxicidad del medio.

A gram-positive, nonpathogenic, central endospore-forming, flagellated strain, was successfully isolated from the rhizosphere of Pinus pinaster in Aracena (Spain). Its optimal growth conditions are 28 ◦C, pH 6, and 0 % salinity. It is able to assimilate glucose, L-fucose, L-arabinose, b-metil-Dxylose and shows high catabolic capacity. The major fatty acids (>79.20 % of the total fatty acids) are anteiso C15:0 > iso C15:0 > C14:0. A phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence revealed similarity to P. frigoritolerans DSM8801T (99.9 %), P. castrilensis CECT30509T (99.8 %), and P. simplex DSM1321T (99.6 %). Comparison of whole genomes revealed that strain BBB004T is more similar to P. simplex DSM1321T. According to ANI (93.54 %), AAI (94 %), dDDH (60.6), %G + C (0.12), TETRA (0.99822) and intergenomic distance (0.2835) values, therefore this species is different to the closest. A total of 133 genes unique to Peribacillus BBB004T were identified. Supported by these analyses, strain BBB004T (=LMG32742T = CCUG76477T) was proposed as the type strain for a new species, named “Peribacillus aracenensis sp. nov.”