Browsing by Author "Escrivá Fernández, Josep"

Background: Multiple myeloma (MM) is the second most common hematologic neoplasm which is characterized by proliferation and infiltration of plasmatic cells in the bone marrow. Currently, MM is considered incurable due to resistance to treatment. The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for understanding the role of different genetic alterations in the pathogenesis of hematologic malignancies in both cell lines and mouse models. Despite current advances of gene editing tools, the use of CRISPR/Cas9 technology for gene editing of MM have not so far been extended. In this work, we want to repress Rnd3 expression, an atypical Rho GTPase involved in several cellular processes, in MM cell lines using a CRISPR interference strategy. Results: We have designed different guide RNAs and cloning them into a lentiviral plasmid, which contains all the machinery necessary for developing the CRISPR interference strategy. We co-transfected the HEK 293T cells with this lentiviral plasmid and 3rd generation lentiviral envelope and packaging plasmids to produce lentiviral particles. The lentiviral particles were used to transduce two different multiple myeloma cell lines, RPMI 8226 and JJN3, and downregulate Rnd3 expression. Additionally, the impact of Rnd3 expression absence was analyzed by a transcriptomic analysis consisting of 3' UTR RNA sequencing. The Rnd3 knock-down cells showed a different transcriptomic profile in comparison to control cells. Conclusions: We have developed a CRISPR interference strategy to generate stable Rnd3 knockdown MM cell lines by lentiviral transduction. We have evaluated this strategy in two MM cell lines, and we have demonstrated that Rnd3 silencing works both at transcriptional and protein level. Therefore, we propose CRISPR interference strategy as an alternative tool to silence gene expression in MM cell lines. Furthermore, Rnd3 silencing produces changes in the cellular transcriptomic profile.

El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia hematológica muy común, caracterizada por la proliferación excesiva de células plasmáticas diferenciadas a partir de linfocitos B en el interior de la médula ósea. Esta enfermedad presenta diferentes etapas en las que evoluciona desde periodos tempranos asintomáticos hasta la manifestación de síntomas clínicos típicos del MM. A pesar de que actualmente existen diversos tratamientos para el MM, es frecuente la aparición de recaídas, siendo la tasa relativa de supervivencia a 5 años es del 50%. Esto implica que, a pesar de los avances científicos de los últimos años, la enfermedad sigue considerándose incurable, por lo que es necesario conocer con mayor profundidad los mecanismos celulares que intervienen tanto en el desarrollo de la enfermedad como en la aparición de resistencias al tratamiento. El objetivo de este trabajo es estudiar el papel de Rnd3 en el MM. Rnd3 es una proteína Rho atípica incluida dentro de la subfamilia Rnd. Las proteínas Rho están clásicamente implicadas en la reorganización del citoesqueleto de actina y han sido ampliamente relacionadas con procesos de transformación celular, destacando su implicación en la proliferación y la migración de las células tumorales. En el caso concreto de Rnd3 también existen evidencias que la relacionan con la progresión tumoral, aunque su función oncogénica u oncosupresora es dependiente del tipo celular y tumoral. Datos previos indican un incremento de la expresión de RND3 en muestras de MM procedentes de modelos murinos que mimetizan la enfermedad humana, así como también en células plasmáticas procedentes de pacientes con MM respecto a células plasmáticas sanas. Para profundizar en el papel de Rnd3 en el MM hemos generado dos líneas celulares de MM (RPMI 8226 y JJN3) deficientes en Rnd3, y hemos analizado su efecto en los procesos de proliferación, adhesión celular y sensibilidad a fármacos. Por otro lado, hemos realizado un estudio transcriptómico para determinar el papel de Rnd3 en la regulación de la expresión de genes implicados en MM. Como resultado destaca la expresión diferencial del gen que codifica para una quimiocina, CXCL10, que se encuentra implicada en la migración de las células del sistema inmuntario y que recientemente se ha relacionado con fenómenos de inmunoterapia e inmunovigilancia en diferentes tumores. Finalmente, hemos validado estos resultados en células deficientes en Rnd3 observando un incremento en la expresión de esta quimiocina, tanto a nivel de mRNA como de expresión proteica. Así pues, estos resultados indican un papel inhibidor de Rnd3 sobre la expresión de CXCL10. Sin embargo, esto no tiene un efecto sobre las propias células tumorales, sugiriendo un papel paracrino de CXCL10 sobre el microambiente tumoral y sobre el sistema inmunitario. En conjunto, este trabajo sugiriere un nuevo papel de Rnd3 en la regulación de la expresión de CXCL10 y su posible papel en la patología del MM.

Autophagy is a highly conserved process that mediates the targeting and degradation of intracellular components to lysosomes, contributing to the maintenance of cellular homeostasis and to obtaining energy, which ensures viability under stress conditions. Therefore, autophagy defects are common to different neurodegenerative disorders. Rnd3 belongs to the family of Rho GTPases, involved in the regulation of actin cytoskeleton dynamics and important in the modulation of cellular processes such as migration and proliferation. Murine models have shown that Rnd3 is relevant for the correct development and function of the Central Nervous System and lack of its expression produces several motor alterations and neural development impairment. However, little is known about the molecular events through which Rnd3 produces these phenotypes. Interestingly we have observed that Rnd3 deficiency correlates with the appearance of autophagy impairment profiles and irregular mitochondria. In this work, we have explored the impact of Rnd3 loss of expression in mitochondrial function and autophagy, using a Rnd3 KO CRISPR cell model. Rnd3 deficient cells show no alterations in autophagy and mitochondria turnover is not impaired. However, Rnd3 KO cells have an altered mitochondria oxidative metabolism, resembling the effect caused by oxidative stress. In fact, lack of Rnd3 expression makes these cells strictly dependent on glycolysis to obtain energy. Altogether, our results demonstrate that Rnd3 is relevant to maintain mitochondria function, suggesting a possible relationship with neurodegenerative diseases.