Los virus de ARN son patógenos de alta impacto clínico y veterinario, muchos de ellos de reciente aparición como el SARS-CoV-2 o bien los reemergentes como el Zika se han convertido en un foco de interés. Todos los virus de ARN replican sus genomas a través de una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). Esta proteína es única, lo que la convierte en una diana para el desarrollo de antivirales con alta especificidad. Aquí se describe un método basado en fluorescencia para monitorizar la actividad de polimerización a tiempo real de las RdRp. El uso de moldes de ARNmc homopolimérico, permite detectar la síntesis de novo de ARNbc con un tinte intercalante. Gracias a este método, se han podido descubrir y caracterizar dos nuevos INAN de la polimerasa del virus del Zika: TCMDC-143406 y TCMDC-143215. Además, mediante ligeras adaptaciones, se ha podido medir en tiempo real la actividad de las RdRp de FMDV y HCV junto con la polimerasa de SARS-CoV-2. Los resultados demuestran que la plataforma basada en fluorescencia para medir la actividad polimerasa a tiempo real, representa una alternativa rápida, económica, fiable y eficaz para la medida de la actividad de distintas RdRp y el cribado de compuestos con potencial efecto inhibitorio frente a estas proteínas.